新行标应对—NY/T 4630-2025 牛乳及其制品中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的测定

引        言

 

生牛乳中富含多种天然活性蛋白，如 α-乳白蛋白 (α-Lactalbumin)、β-乳球蛋白 (β-Lactoglobulin)、乳铁蛋白(Lactoferrin, LF)、免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG) 和乳过氧化物酶 (Lactoperoxidase, LP) 等，这些天然活性蛋白在抵抗细菌、病毒入侵，增强免疫力，促进组织修复和生长发育等方面发挥着重要作用。其中 α-乳白蛋白具有抗癌、抗菌和抗病毒作用，调节免疫功能，促进乳糖合成和乳分泌；β-乳球蛋白具有降胆固醇、抗氧化和抗病毒活性，促进脂溶性维生素的消化吸收。不同的热处理方式（巴氏杀菌、超高温 (UHT) 灭菌、蒸发浓缩及喷雾干燥等），会导致乳制品中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白出现不同程度的变性失活，从而影响其营养价值及市场售价。

 

 

 

赛默飞新行标应对方案亮点

 

1.本试验参考 NY/T 4630-2025 以及相关团体标准和企业标准，对巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳和婴幼儿配方奶粉中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的含量进行测定。NY/T 4630-2025 将于 2025 年 5 月 1 日正式实施。

2. 本试验采用 2.6 μm 粒径的实心核颗粒 Accucore 150 C4 色谱柱，配合更低的流速 (0.8 mL/min)、更小的进样体积 (10 μL) 和 更高的采样频率 (10 Hz)，使得 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的峰形及分离度均由于标准。

3. 为获得良好的峰形和分离度，试验对样品前处理和液相色谱条件进行了适当优化，在柱温 60 ℃、流速 0.8 mL/min 条件下，以 0.1% 三氟yi酸水-0.1% 三乙腈 作为流动相进行梯度洗脱，系统最大压力值不超过 110 bar。

4. 试验结果表明：α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白色谱峰形良好，柱效优异，分离度卓越，其中 α-乳白蛋白主峰与附近干扰峰的分离度显著优于标准谱图。α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液 (100 μg/mL)，α-乳白蛋白保留时间为 21.900 min，不对称因子 0.98，理论塔板数 321137；β-乳球蛋白 B 保留时间为 24.747 min，不对称因子 1.01，理论塔板数 352451；β-乳球蛋白 A 保留时间为 25.467 min，不对称因子 1.00，理论塔板数 373359；α-乳白蛋白与 β-乳球蛋白 B 分离度为 17.77，β-乳球蛋白 B 与 β-乳球蛋白 A 分离度为 4.33；连续四次进样，保留时间和峰面积的 RSD 均小于 0.3%，方法重现性好；α-乳白蛋白标准品溶液线性范围 0.00-200 μg/mL，线性相关系数 r2≥0.9997，β-乳球蛋白标准品溶液线性范围 0.00-200 μg/mL，线性相关系数 r2≥0.9991，线性良好。

5. 在反相液相色谱法测定乳制品中 α-乳白蛋白与 β-乳球蛋白含量的试验中，Accucore 150 C4 色谱柱配合 Vanquish Core 高效液相色谱系统，表现出了良好的重现性和优异的稳定性，方法检出限和定量限均满足标准要求，可供乳制品企业及食品检测实验室参考。

6.参考相关文献，在凝胶渗透色谱法测定乳制品中 α-乳白蛋白与 β-乳球蛋白含量的试验中，串联使用两支 MAbPac SEC-1 (300 Å, 5 μm, 7.8×300 mm) 体积排阻色谱柱，以 6 M 盐酸胍为流动相进行等度洗脱，在 280 nm 下可有效分离 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白。

 

 

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NY/T 4630-2025

 赛默飞完整应用解决方案

 

01

样品前处理

1.1 液体试样：低温奶（生牛乳、巴氏杀菌乳）/ 常温奶（超高温(UHT)灭菌乳）

称取试样 5 g（精确到0.1 mg）于 50 mL 带刻度旋盖离心管中，加适量水涡旋混匀 30 s，用适量乙酸调节 pH 为 4.60±0.05 后，用水定容至 25.0 mL，涡旋混匀 1 min，静置 30 min 以上，12000 rpm 4 ℃ 离心 15 min。取上清液（可酌情用超纯水进行稀释），过 0.2 μm 亲水性 PTFE 微孔滤膜 (P/N: 42213-NPL)，滤液待上机测试。

1.2 固体试样：乳粉（婴幼儿配方奶粉）

称取试样 2 g（精确到0.1 mg）于 50 mL 带刻度旋盖离心管中，加适量水涡旋混匀 1 min 使其充分溶解（必要时可温水浴化开），用适量乙酸调节 pH 为 4.60±0.05 后，用水定容至 25.0 mL，涡旋混匀 1 min，静置 30 min 以上，12000 rpm 4 ℃ 离心 15 min。取上清液（可酌情用超纯水进行稀释），过 0.2 μm 亲水性 PTFE 微孔滤膜 (P/N: 42213-NPL)，滤液待上机测试。

 

 

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02

仪器配置及色谱条件

Thermo Scientific™ Vanquish Core™ 高效液相色谱系统，配置：泵 Quaternary Pump C (VC-P20-A)，自动进样器 Split Sampler CT (VC-A12-A)，柱温箱 Column Compartment C (VC-C10-A)，检测器 Diode Array Detector CG (VC-D11-A)，数据处理 Chromeleon™ 7.3

色谱柱：Accucore 150 C4, 2.6 μm, 4.6×150 mm    (P/N: 16526-154630)

流动相：A: 0.1% 三水        B: 0.1% 三乙腈

流速：0.8 mL/min

梯度洗脱程序：

 

进样量：10 µL

柱温：60 ℃

检测器：DAD, 采集波长: 210 nm；采集频率: 10 Hz；光谱采集: 190-400 nm

 

 

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03

谱图及数据

3.1 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液的分离谱图及数据

 

图 1 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液的分离谱图及数据 (100 μg/mL)（点击查看大图）

如图 1 所示，α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白色谱峰形良好，柱效优异，分离度优于标准。α-乳白蛋白保留时间为 21.900 min，不对称因子 0.98，理论塔板数 321137；β-乳球蛋白 B 保留时间为 24.747 min，不对称因子 1.01，理论塔板数 352451；β-乳球蛋白 A 保留时间为 25.467 min，不对称因子 1.00，理论塔板数 373359。α-乳白蛋白与 β-乳球蛋白 B 分离度为 17.77，β-乳球蛋白 B 与 β-乳球蛋白 A 分离度为 4.33。

 

3.2 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白单一标准品溶液定位叠加谱图

 

图 2 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白单一标准品溶液定位叠加谱图（点击查看大图）

α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白单标定位色谱图及光谱图，如图 2 所示，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 均在 200 nm 和 279 nm 处有特征吸收。

 

3.3 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液连续进样叠加谱图

 

图 3 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液连续进样叠加谱图 (100 μg/mL, n=4)（点击查看大图）

α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液 (100 μg/mL) 连续四次进样，保留时间和峰面积的 RSD 均小于 0.3%，方法重现性好，分离谱图及数据详见图 3。

 

3.4 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准品溶液校准曲线叠加谱图

 

图 4 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准品溶液校准曲线叠加谱图 (0.00/40.0/80.0/120/160/200 μg/mL)（点击查看大图）

生牛乳、巴氏杀菌乳中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的含量通常都较高，因而选取了 T/TDSTIA 002-2021 和 T/TDSTIA 007-2019 两个团体标准推荐的线性范围。如图 4 所示，α-乳白蛋白标准品溶液线性范围 0.00-200 μg/mL，线性相关系数 r2≥0.9997，β-乳球蛋白标准品溶液线性范围 0.00-200 μg/mL，线性相关系数 r2≥0.9991，线性良好。其中 β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 采用化合物组进行定量。

 

3.5 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准品溶液 (40.0 μg/mL) 与空白溶液叠加谱图

 

图 5 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准品溶液 (40.0 μg/mL) 与空白溶液叠加谱图（点击查看大图）

当进样体积为 10 uL 时，以 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白 (40.0 μg/mL) 的峰高为 S，选取 22.5-24.0 min 基质噪音的平均值为 N，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 的信噪比 S/N 分别为 523.3、139.9 和 133.6，如图 5 所示。因此，配合进样体积的优化，α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白测定方法灵敏度亦可满足 NY/T 4630-2025 中 1.00 μg/mL 的要求。

 

3.6 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液与巴氏杀菌乳样品溶液叠加谱图

 

图 6 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合标准品溶液与巴氏杀菌乳样品溶液叠加谱图（点击查看大图）

除乳清蛋白外，牛乳中还含有大量的酪蛋白和其他蛋白，可能会对 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的测定产生干扰。巴氏杀菌乳样品经调节 pH 、高速离心等前处理操作后，未变性的 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白保留在上清液中，其分离保留的峰型较好、基线平稳且出峰时无干扰，如图 6 所示。采用外标法定量，巴氏杀菌乳样品中 α-乳白蛋白为 1033.6 mg/kg和 β-乳球蛋白含量为 2949.0 mg/kg，基本与标签值相符。

 

3.7 巴氏杀菌乳（低温奶）、超高温灭菌乳（常温奶）及婴幼儿配方奶粉样品溶液分离谱图及数据

 

图 7 巴氏杀菌乳（低温奶）样品溶液分离谱图及数据

（点击查看大图）

 

图 8 超高温灭菌乳（常温奶）样品溶液分离谱图及数据

（点击查看大图）

 

图 9 婴幼儿配方奶粉样品溶液分离谱图及数据

（点击查看大图）

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α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白对温度较敏感‌，高温会破坏其化学结构及生物活性。如图 7-9 所示，巴氏杀菌乳（低温奶）中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白目标峰附近均不存在明显干扰峰，可准确定性和定量，生牛乳、巴氏杀菌乳等样品适用于 NY/T 4630-2025 第一法；而超高温灭菌乳（常温奶）和婴幼儿配方奶粉中 β-乳球蛋白目标峰附近存在明显干扰峰，会严重影响定性和定量结果，α-乳白蛋白受影响相对较小，超高温灭菌乳、婴幼儿配方奶粉等样品不适用于 NY/T 4630-2025 第一法，建议采用第二法。

 

3.8 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准溶液凝胶渗透色谱图（第二法）

 

图 10 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白标准溶液 (500 mg/L) 凝胶渗透色谱图（点击查看大图）

参考杜茹芸老师在《中国乳品工业》期刊发表的文章《体积排阻色谱法测定牛奶、乳粉、乳清粉中 α-乳白蛋白的含量》（2022 年），串联使用两支 MAbPac SEC-1 (300 Å, 5 μm, 7.8×300 mm) 体积排阻色谱柱，以 6 M 盐酸胍为流动相进行等度洗脱，在 280 nm 下可有效分离 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白（如图 10 所示），并测试了 60 个批次的牛奶、奶粉及乳清粉，以验证方法适用性和稳定性，相关谱图及数据详见原文。

文中选用 MAbPac SEC-1 色谱柱规格为 7.8×300 mm，推荐流速为 0.5 mL/min，在确保分离度的前提下实现溶剂节省，可选用 4.0×300 mm 规格色谱柱，建议流速为 0.2 mL/min （可酌情适当调整）。

04

NY/T 4630-2025 相关色谱耗材推荐

4.1 第一法 反相液相色谱法 分析柱及保护柱

Accucore 150 C4, 2.6 μm, 4.6×150 mm

(P/N: 16526-154630)

Accucore 150 C4 保护柱柱芯, 2.6 μm, 4.0×10 mm, 4 pk

(P/N: 16526-014005)

Uniguard 直连式保护柱柱套

(P/N: 850-00)

4.2 第二法 凝胶渗透色谱法 分析柱及保护柱

流速：0.5 mL/min

保护柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×50 mm

(P/N: 074697)

分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 7.8×300 mm

(P/N: 088460)

分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 7.8×300 mm

(P/N: 088460)

流速：0.2 mL/min

保护柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×50 mm

(P/N: 074697)

分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×300 mm

(P/N: 074696)

分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×300 mm

(P/N: 074696)

4.3 样品前处理

Titan 3 亲水性 PTFE 针式过滤器，17 mm, 0.2 μm, 200/pk

(P/N: 42213-NPL)

 

 

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05

参考文献

[1] NY/T 4630-2025 牛乳及其制品中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的测定 高效液相色谱法

[2] T/TDSTIA 026-2022 婴幼儿配方乳粉中 α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的测定-凝胶渗透色谱法

[3] T/TDSTIA 002-2021 奶及奶制品中 α-乳白蛋白的测定 高效液相色谱法

[4] T/CSIQ 77001-2020 乳制品中 α-乳白蛋白含量的测定 高效液相色谱法

[5] T/TDSTIA 007-2019 奶及奶制品中 β-乳球蛋白的测定 液相色谱法

[6] T/SHNX 001-2025 生牛乳中乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定 液相色谱-串联质谱法

[7] 杜茹芸,王亮,林毅侃.体积排阻色谱法测定牛奶、乳粉、乳清粉中 α-乳白蛋白的含量[J].中国乳品工业,2022,50(04):46-51.

 

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