生物制药是生物技术产业中发展最为迅速的部分，以单克隆抗体药物为 标志，目前全球已批准35个抗体药物上市，用于癌症、自身免疫、黄斑变 性、血液病和感染治疗等[1]。在生物制药的每个生产环节，产品的纯化和分 析过程都至关重要。早期抗体的质量控制过程中，必须测定样品的效价、聚 集体和电荷亚型。单克隆药物（MAb）产品中两个主要的杂质是电荷亚型单 抗和单抗聚集体，这些副产物会产生与主产品不同的药效，有时会引起严重 的副作用，如抗药性抗体的形成。蛋白聚体是在生产过程、纯化或者运输过 程中产生（如温度，pH的影响）。本文讨论了采用一套HPLC系统（UltiMate 3000钛系统）同时实现单克隆抗体的聚集体的分离和电荷亚型的分离。 测试条件 仪器：UltiMate 3000钛系统，包括带有在线脱气 单元的双三元梯度泵；带有生物兼容的十通阀；WPS3000T（B）FC分析型，带样品收集功能的自动进样器； 紫外检测器（UV）；二极管阵列检测器（DAD）。系统 连接见图1。 离子交换色谱（IEC右泵） Thermo Scientific MAbPac SCX -10（4 mm i.d. ×250 mm ）色谱柱阳离子交换模式分离单克隆抗体的电 荷亚型色谱条件： 流动相A：20 mM MES缓冲盐，60 Mm NaCl ，pH5.6 流动相B：20 mM MES缓冲盐，300 Mm NaCl ， pH5.5 梯度分离条件：30 min内15-45%B；6 min 100%B清 洗；10 min 15%B平衡 流速：1.0 mL/min 检测波长：280 nm 温度：30 ℃ 体积排阻色谱（SEC左泵） Thermo Scientific MAbPac SEC -1流动相：200 mM 磷酸钠缓冲盐，250 mMNaCl， pH6.8，等度分离 流速：0.25 mL/min 检测波长：280 nm 温度：30 ℃ 样品前处理 单克隆抗体样品由中科院生物物理研究所提供，浓度 约为5 mg/mL，12000转/min离心10 min，取上清液过滤 后分别用流动相稀释5倍，得到浓度为1 mg/mL的溶液直 接进样分析。 牛血清白蛋白（分子量66 KDa，等电点pI为4.7）、 卵清蛋白（分子量44 KDa，等电点pI为4.7）和细胞色素C （分子量12 KDa，等电点pI为10.7），购于Sigma公司。 取牛血清白蛋白样品适量，精密称定，加超纯水溶 解，制成每2 mg/mL的溶液。 取卵清蛋白样品适量，精密称定，加超纯水溶解，制 成每2 mg/mL的溶液。 取细胞色素C样品适量，精密称定，加超纯水溶解， 制成每0.25 mg/mL的溶液。 按照相同的方法配置三种蛋白的混合溶液。